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アナライザーからのインピーダンス データはコンピューター に転送され、分析され、統合ソフトウェア によって処理されます。 個々のウェル内の電極間で測定されるインピーダンスは、電極の形状、ウェル内のイオン濃度、および電極に細胞が付着しているかどうかによって異なります。 細胞-MACROS-が存在しない場合、電極インピーダンスは主に電極/溶液界面とバルク溶液-MACROS-の両方のイオン環境によって決まります。 細胞が存在する場合、電極センサー表面に付着した細胞は電極/溶液界面の局所イオン環境を変化させ、インピーダンスの増加につながります。 このシステムは、3 つの要素、アナライザー、E プレート ステーション、およびマイクロ電極が統合された 96 ウェル マイクロタイター E プレート を含むように構成されています。 細胞が電極表面に付着し、回路内の電流を部分的に遮断し、電極インピーダンスの増加につながります (中央のパネル)。 2 つのセルが電極表面に付着して電流がさらに減少し、上部パネルと中央パネル (下部パネル) と比較してインピーダンスが 2 倍になります。 電極上の細胞数が同じ場合、細胞の付着が良くなり、電極上への細胞の広がりが大きくなると、電極インピーダンスが大きく増加します（下図）[13]。細胞電極インピーダンスが増加する。 さらに、インピーダンスの変化は、細胞の形態や、どの細胞が電極に付着するかの程度によっても異なります。 周波数依存電極インピーダンス 8 微生物およびウイルス感染の機能評価。 インピーダンス読み取り機能は、細胞数-MACROS-、形態-MACROS-、接着におけるこれらの固有の変化を利用して定量化し、特定の細胞プロセスをリアルタイムで偏りなく検出することを可能にします-MACROS-。 そのため、-MACROS-、ラベルフリー-MACROS-、リアルタイム細胞ベース技術は、細胞分析-MACROS-での実装において最近大きな注目を集めています。 名前が示すように、-MACROS- では、ラベルを排除することで、細胞プロセスに対するラベルの潜在的な悪影響を回避し、細胞を本来の生理学的に関連する環境で評価することができます。 特定のラベルやレポーター、特に生細胞のラベルを追加すると、細胞の挙動のさまざまな側面に影響を及ぼすことがわかっています。 ラベルフリー技術には非侵襲性という利点もあり、そのため組織培養ウェル内に存在する生細胞を継続的に調べることができます。 この特徴は、ラベルフリー技術の主な利点の1つであるリアルタイムの運動測定に直接つながります[12、2023]。 細胞プロセスのリアルタイムモニタリングは、従来のエンドポイントアッセイ-MACROS-に比べて明確かつ重要な利点を提供します。 まず、アッセイの全体の長さを包括的に表現できるため、ユーザーは操作や処理のタイミングに関して十分な情報に基づいた決定を下すことができます。 2 番目、細胞の実際の運動反応は、成長、停止、形態変化 などの細胞の生物学的状態に関する重要な情報を提供します。 この技術は、細胞毒性-MACROS-、細胞接着および拡散-MACROS-、受容体介在シグナル伝達および細胞浸潤および移動の機能モニタリング-MACROS-、幹細胞由来心筋細胞拍動[2428]-MACROS-など、多くの細胞ベースのアッセイに応用されています。 したがって、このシステムは、細菌検出のための機能アッセイとして機能するのに適しています。 毒素効果と細菌と宿主細胞の相互作用に対する宿主細胞の応答を機能的に検出するためのシステムの有用性を実証するために、このシステムを使用して、クロストリジウム・ディフィシル (C を含む微生物毒素への曝露後の細胞プロセスの in vitro テストを実施しました。 実際の臨床患者サンプルで検出と感度が達成できるかどうかは、まだテストされていません。 この毒素は細胞に対して細胞毒性効果を引き起こし、その結果、用量依存的かつ時間依存的に細胞インピーダンスが減少しました。

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特定の色分けされたビーズ セットに関連付けられていない信号はすべて、バックグラウンド と見なされます。 緑色レーザーは、ビーズ-MACROS-によって捕捉されたわずか 8 個の蛍光標識プローブの信号を検出できます。 ビーズ製造、カラーコード染色、キャプチャプローブのカップリングから製品のハイブリダイゼーションおよびデータ収集まで、すべてが均質な溶液内で行われるため、このプラットフォームでは再現性の高い結果が得られます。 通常、-MACROS- では、色分けされたビーズ セット ごとに、反応ごとに 5,000 個のビーズが追加されます。 各ビーズ セットは、突然変異や病原体 などの特定の疾患マーカー に特化しています。 したがって、-MACROS- では、データは標準アレイ によって生成された 1 つのデータ ポイントではなく、100 個のマイクロビーズ関連データ ポイント を表します。 未反応のシグナル増幅試薬を除去するために、さらに 1 回の洗浄ステップが実行されます。 その後、結果の定性分析（配列の読み取り）を Verigen Reader で実行できます。 統合ソリューション 統合ソリューションとは、サンプルから回答までの結果を できるようにさまざまな方法論と機器を組み込んだソリューションです。 これらの企業は、増幅方法、検出プラットフォーム、5 つ以上のターゲットのマルチプレックス化機能、サンプル準備、増幅、および検出手順を完全に統合して最大 3 分未満の実作業時間を可能にすること、およびアンプリコン汚染を排除できるクローズド反応システムというカテゴリで比較されています。 これらの手順は自動化が難しく、密閉されたシステムで実行することも難しいため、アンプリコン汚染のリスクがあり、偽陽性の結果や高いバックグラウンドにつながる可能性があります。 さらに興味深いことに、サンプル中に複数の病原体が検出され、患者の30%以上が重複感染していたことが判明しました[7]。 このシステムは、ブドウ球菌の同定と薬剤耐性遺伝子の検出のためのマルチプレックスアッセイ で 18 個の分子ターゲットを検出しました。 StaphPlex システムは、95 の範囲で 100 % の感度と特異性を実証しました。 ただし、増幅およびハイブリダイゼーション反応は依然としてオープンな環境で行われるため、アンプリコン汚染の潜在的なリスクは依然として存在します。 この低コストのソリューション により、 は新興市場での製品の受け入れやすさが向上しました。 自動化の欠如と潜在的なアンプリコン汚染により、同社の製品が西洋市場に浸透する能力が制限される可能性があります。 iCubate テクノロジーの中核となるのは、抽出、増幅、検出の各ステップを実行するために必要なすべての試薬が事前にロードされた使い捨てカセットです。 カセットの密閉設計により、内部に含まれる高濃度アンプリコンがラボ を汚染する可能性がなくなります。 iCubate iC-Processor を使用すると、iCubate カセット の自動処理が可能になります。 各プロセッサは、ランダム アクセス方式で 1 ​​～ 4 個のカセットを実行できます。さらにスループットが必要な場合は、最大 12 個のユニットをリンクして、最大 48 個のサンプルを同時に実行できます。 高速回転プラッター、レーザー、および光電子増倍管により、わずか数秒で各カセットからデータを取得できます。 iCubate iC-Report ソフトウェアは自動データ分析を実行し、各カセット ごとに個別のレポートを生成します。 Cepheid、Gentura Dx、Idaho Technology などの企業はいずれも、汚染のないクローズド システムで分子アッセイを実行できるサンプルから結果までのソリューションを開発しています。 それにもかかわらず、これらのプラットフォームの使いやすさは分子診断業界に革命をもたらし、何百万人もの患者に利益をもたらしました。 コスト削減と命の救助を通じて価値を提供するゲノム技術の進歩により、病気の定義方法が、臨床症状の表現型による症状説明から、根本的な原因の遺伝子型による分子分類による病気の定義に変わりました。 分子鑑別診断は、21 世紀の医療実践 の特徴となっています。

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この病気は、このウイルスが風土病となっている地域（特に日本と西インド諸島）で最もよく見られますが、ウイルスが見つかる世界の他の多くの地域でも、頻度は低いものの散発的に症例が発生しています-MACROS-。 したがって、この病気は中東-MACROS-、中央および西アフリカ、南アメリカ-MACROS-で発生する可能性があります。 一般的な臨床症状は、皮膚の発疹（皮膚浸潤を反映）-MACROS-、リンパ節腫脹-MACROS-、肝腫大-MACROS-、脾腫大および高カルシウム血症-MACROS-です。 後者の症状は、腫瘍細胞（マクロス）から分泌されるサイトカインによる破骨細胞の活性化によって引き起こされます。 これらには、クリプトコッカス症-MACROS-、カリニ肺炎、および糞線虫による過剰感染-MACROS-が含まれます。 これらの細胞は非常に多形性があり、中程度の量の細胞質と、多くの場合核小体である不規則な形の核を持っています - マクロ -。 細胞の一部は分葉状になっており、核の形が花に似ています -マクロ-。 少数の細胞は核質比が高く、分葉化があまり目立たないため、セザリー細胞（マクロス）に似ています。 一部の細胞はより拡散したクロマチンパターンを持ち、一部は免疫芽球に似ています。これらは、顕著な核小体と豊富な好塩基性細胞質（マクロス）を持つ大型細胞です。 ほとんどの場合、細胞は中型または大型の過染色核を持ち、不規則な 、渦巻き状または分葉状の輪郭、および顕著な核小体 を伴う顕著な多形性を示します。 浸潤領域（マクロ）内には、形質細胞と好酸球の数が増加していることがよくあります。 症例によっては、破骨細胞（マクロス）を含むハウシップ窩が顕著になり、骨吸収が増加していることがあります。 胸水や腹水が時々発生し、その場合、滲出液中に非常に異型の細胞が存在します。 浸潤物は多形性であることが多く、顕著な核多形性（マクロス）を示す中型細胞と大型細胞が混在しています。 真皮内には密なリンパ浸潤があり、多くの場合皮下組織まで広がっています。 慢性リンパ性白血病における皮膚病変の臨床的および免疫組織学的特徴。 慢性リンパ性白血病ステージ 0 およびステージ 1 における白血病性軟膜浸潤。 前立腺摘出術および前立腺生検時に発見された偶発的および同時発生の悪性リンパ腫：29 症例の研究。 B 細胞前リンパ性白血病と慢性リンパ性白血病には、特徴的な遺伝子発現シグネチャー があります。 T細胞性前リンパ球性白血病におけるアレムツズマブ投与後の幹細胞移植は、アレムツズマブ単独投与後よりも生存期間が長くなる：多施設後ろ向き研究。 菌状息肉腫の腫瘍ゲノム解析により、セザリー症候群との大きな違いが明らかになりました。 成人T細胞白血病リンパ腫の定義-MACROS-、予後因子-MACROS-、治療-MACROS-、および反応基準：国際コンセンサス会議-MACROS-からの提案。 成人T細胞白血病/リンパ腫における比較ゲノムハイブリダイゼーション解析：臨床経過との相関。 慢性リンパ性白血病に関する新たな知見：私たちはこの疾患の病因の理解に近づいているのか？限定された免疫グロブリン遺伝子の再編成特性を持つサブセットは、慢性リンパ性白血病の発症における抗原選択の役割を示唆している。 白血病として現れるリンパ増殖性疾患は、他の場所で検討されています (第 28 章を参照)、および形質細胞腫瘍 (第 30 章を参照) も同様です。 病変が深部のみに及んでいる虚弱患者や高齢患者の場合、診断的リンパ節生検は実行できない可能性があります。 さまざまなリンパ増殖性疾患 において、これらの各タイプの標本の価値は、より高くなる場合もより低くなる場合もあります。

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これは、処理ミスの結果として、または複雑な処理手順 に起因する汚染によって、テストの精度に影響を与える可能性があります。 自動化方法 市販の手動抽出キットの導入は、臨床微生物学研究所-MACROS-における分子検査の貴重な補助手段となりました。 しかし、手動抽出方法は依然として労働集約的で時間がかかり、十分に訓練された技術者が必要です。 サンプルを同時に処理した場合に交差汚染が発生したという報告もあった[39, 75]。 近年、多くのメーカーが様々な自動抽出装置を開発し、発売しています。220 表 11。 Shin 試験片/実行（バッチサイズ） 24 12 32（132） 8（18） 96（8） 96（124） 96（896） 16（116） 96（24） 384（1384） 196（196） 96（8） これらの機器は、原理-MACROS-、手順時間-MACROS-、コスト-MACROS-、およびサイズが異なります（表11-MACROS-）。 核酸の回収における一定の再現性 を提供し、手動抽出方法 で見られるような個人間のばらつきを回避します。 また、不必要な取り扱い手順を減らし、人員によるミスを回避することで、交差汚染を減らすこともできます[5]。 手動方式では品質管理モニタリングに集中的な作業が必要になるのに対し、この方式には品質管理モニタリング-MACROS-に対する追加の利点がある[77]。 多くの自動抽出器具やキットが開発されて以来、数多くの評価が報告されている[67, 7881]。 これらの研究には、さまざまな種類の抽出キット、臨床検体、病原体 が含まれていました。 いくつかの報告では手動抽出方法-MACROS-で高い検出率を示していますが、ほとんどの研究では自動抽出方法の結果は-MACROS-と同等か、手動方法よりも優れていました[28、29、45、64、67、7881]。 ウイルス収量 には若干のばらつきがありましたが、手動キット の収量と比較するとわずか 50% でした。 臨床診療におけるウイルス量の生物学的範囲を製造元の推奨事項である MACROS として考慮すると、収量の違いはそれほど重要ではありません。 自動抽出装置「MACROS」の評価では、さまざまな結果に直面する可能性があります。 考慮しなければならない最も重要な欠点は、自動化された方法（マクロ）の経済的側面です。 このようなシステム を使用するには、高価な機器と、使い捨て品 を含む抽出試薬 が必要です。 しかし、2009 年のインフルエンザ A (H1N1) パンデミックにより、自動抽出システム の価値が実証されました。 当時、インフルエンザA（H1N1）の識別の要求が急増しており、多くの研究所では人員が限られているため、要求されたすべての検査を実行することができませんでした。 検出率と収量回収率は市販の抽出方法を選択する上で最も重要な要素であるが、使いやすさや抽出あたりのコストなど他の要素も考慮する必要がある[28]。 結論近年、高度な分子検査は、その高い感度と特異性により、感染症の診断において重要な位置を占めるようになっている[83、84]。 最適な抽出方法は、速度-MACROS-、作業時間の短さ-MACROS-、費用対効果-MACROS-、高い感度と特異性-MACROS-、良好な再現性-MACROS-、安全性[1]-MACROS-などの条件を満たす必要があります。 しかし、現時点では、これらすべての条件を満たす抽出方法は存在しません。 逆に、特定の臨床検体では核酸が異なる可能性があるため、抽出キット間には大きな違いがあります。 したがって、臨床微生物学研究室で使用される抽出方法のパフォーマンスを慎重に評価することが重要です。 Mancini N、Carletti S、Ghidoli N、Cichero P、Burioni R、Clementi M (2010) 敗血症の診断における分子およびその他の非培養ベースの方法の時代。 Gerna G、Lilleri D (2006) 移植患者におけるヒトサイトメガロウイルスのモニタリング：診断アップデート。

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分子タイピングの目的は染色体の類似性の比較ですが、電気泳動バンドパターンはこの問題に間接的にしか対処しません。 プロセスを支援するコンピュータ プログラム があるにもかかわらず、最終評価 に影響を与える可能性のあるエンド ユーザーの判断の要素が常に存在します。 対照的に、ヌクレオチド配列データを使用すると、直接的かつ明確なゲノム比較が可能になります。 単一遺伝子座配列タイピング 細菌病原体のゲノムはメガベースのサイズであるため、単一の遺伝子座が ca であると考えるのは注目に値します。 ヨーロッパでは、これにより、特定の S の疫学的モニタリングにおける SPA タイピングの正式な組織的使用が実現しました。 化膿連鎖球菌 M タンパク質 (emm) 細胞表面 M タンパク質の分類は、S における重要な毒性因子です。 ゲノム解析により、M タンパク質遺伝子座 (emm) は可変であり、最初に血清学的に検出されカタログ化された 少なくとも 100 種類の異なる M タンパク質タイプをエンコードできることが明らかになりました。 その結果、配列に基づくemmタイピングは現在、A群連鎖球菌疫学[5356]に最も広く使用されているアプローチとなっています。 世界のさまざまな地域における特定の疾患に寄与する emm タイプの Goering。 通常、7 つの遺伝子 (-MACROS-) が使用され、その配列には数値の対立遺伝子指定 (-MACROS-) が割り当てられます。 ただし、数千の特定のオリゴヌクレオチドプローブを使用するアレイベースの方法では、これは当てはまりません。 このアプローチの威力は、臨床的に関連するさまざまな生物の特性評価に応用されてきました[3、7072]。 しかし、マイクロアレイはハイスループットゲノム解析の可能性を秘めているものの、日常的な臨床使用には費用対効果が高くありません。 さらに、特にデータ解析には高度な技術的専門知識が必要であり、部分的なハイブリダイゼーションなどによる「バックグラウンド」ノイズによって複雑になることがあります。 しかし、このサスペンションベースの手法によるひずみのタイピングの有用性は、まだ徹底的に評価されていません。 全ゲノム配列タイピング 前述のように、分子株タイピングの目的は、細胞内の最も基本的なアイデンティティ分子である細菌染色体に基づいた疫学的評価です。 これは古いジデオキシ/連鎖停止シーケンシング技術[74]では不可能でしたが、新しい-MACROS-では不可能でした。 これらすべては現在、商業技術が向上し、科学市場（マクロ）での位置づけが変化するにつれて流動的になっています。 それにもかかわらず、これらは私たちにとって刺激的な「問題」であり、個別の疫学的相互関係を決定するためのこの最も基本的なアプローチにおけるさらなる注目すべき発展のための科学的な舞台が明らかに整っています。 どちらの技術も新しいものではありませんが、菌株タイピングの応用分野である MACROS において新たな重点が置かれつつあります。 ラマンはこの光散乱技術「マクロス」の発見により、1930年にノーベル物理学賞を受賞しました。 細胞内のすべての分子が散乱レーザー光のスペクトル生成に寄与するため、原理的には、異なる細菌株は異なるラマンスペクトルを生成すると予想されますが、関連性の高い分離株は生成しません。 したがって、SpectraCell システムは、これらのスペクトル測定の定量化に基づいて株の分類を達成することを目指します。 初期の報告では、この方法は P などの問題となる病原体の分類に有望であることが示唆されています。

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クローズドフォーマット法（マイクロアレイ）は、所定のプローブセットアプローチ内にある物質（核酸配列）のみを検出することに限定されています。ここでは、シーケンス方法について簡単に説明します（表 23）。 バーコードベースの454パイロシーケンシングでは、サンプルごとに数十万のシーケンスを提供できます[7577]。 しかし、ハイスループット シーケンシングの大きな利点は、新しいシーケンスを見つける能力です。 一方、マイクロアレイにはプローブするための定義された配列セットがあるため、新しい配列を検出することはできませんが、新しい配列を見つける方法を提供する新しいマイクロアレイアプリケーションが開発されています[55、56] -MACROS。 プライマーの制限 (保存されたプライマーは、いくつかの機能遺伝子を除いて設計するのが困難、一部のサンプルの増幅が困難) により、増幅できる遺伝子の数と種類が大幅に制限されます。 シーケンス技術には、微生物群集の研究に特有の利点と欠点もあります。 ほとんどの研究 では、大量のデータ が得られるにもかかわらず、実際にサンプリングされるのは微生物群集のごく一部だけです。 理論的には、完全にランダムなサンプリングを行うと、複数のサンプリングイベントで同じコミュニティの部分をサンプリングする確率はわずかであるはずです[37]。ただし、優勢な集団は複数回サンプリングされる可能性が非常に高くなります。 対照的に、マイクロアレイベースのアプローチでは、すべてのサンプルを同じプローブ セット に対して調べます。 シーケンスベースのアプローチは種の豊富さの差に非常に敏感ですが、マイクロアレイベースのアプローチは、検出限界を超えている限り豊富さの変化の影響を受けません。 シーケンスされるシーケンスに制限がないため、シーケンスベースのテクノロジーによって新しいシーケンスや新規シーケンスを見つけることができます。 しかし、前述したように、新しいタイプのアレイであるキャプチャーマイクロアレイでは、新しい配列を検出することができ[55、56]、ハイブリダイゼーションパターンに基づいて新しいウイルスを分類できるウイルスチップが設計されています[68、69]。 マイクロアレイ分析の課題 過去 10 年間でマイクロアレイ技術の開発は大きく進歩しましたが、依然として課題が残っています。 これらには、プローブとハイブリダイゼーション条件の感度と特異性、および定量能力 が含まれます。 現在、環境サンプルでは微生物群集の約5%の感度が観察されており[39、83]、最も優勢な群集メンバーのみを検出することができます。 プローブまたはハイブリダイゼーション条件を変更することで感度を高めることもできますが、これらの方法の中には特異性が低下するものもあります。 一般的に、プローブが長いほど感度は高くなります（ただし特異性は低くなります）[36、86、87]。 プローブの密度を高めると感度は向上するが[35, 87, 88]、密度が高すぎると全体的な信号強度が低下し、感度が低下する可能性がある[36]。 ハイブリダイゼーション中に混合すると、信号対雑音比が3倍に増加します[89]。 シアニン色素をドープしたナノ粒子[35]とチラミド信号増幅標識[36]はどちらも、従来のシアニン色素に比べて最大10倍の感度向上をもたらします。 アレイハイブリダイゼーションが起こる部屋のオゾン量を減らすと、オゾンがシアニン色素の信号を減少させるため、感度が向上する可能性がある[90]。 ハイブリダイゼーション条件は特異性に影響します。温度やホルムアミド濃度が高いほど特異性が高まります。 定量化 - 定量的な情報を提供する能力 - MACROS - は、マイクロアレイ - MACROS - にとって望ましい品質です。 結論 過去 10 年間で、マイクロアレイの開発、技術、アプリケーションは大きく進歩しました。 臨床微生物学と病原体検出-MACROS-の分野では、特に興味深い開発がいくつか行われています。